Abstak : Tetrasiklin merupakan golongan antibiotik yang banyak digunakan oleh peternak ayam sebagai obat maupun tambahan pakan untuk memacu pertumbuhan (feed additive). Batas Maksimum Residu (BMR) tetrasiklin dalam produk ternak berdasarkan Standar Nasional Indonesia Tahun 2001 adalah 0,6000 ppm untuk hati. Pada penelitian ini dilakukan pengujian terhadap tiga sampel hati ayam yang beredar di pasaran. Sampel hati ayam dipreparasi terlebih dahulu menggunakan pelarut trikloroasetat 20% dan buffer sitrat pH 4, kemudian dilanjutkan dengan teknik sentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit, dilanjutkan dengan ekstraksi cair-cair menggunakan n-heksan dan dimurnikan menggunakan SPE. Eluen SPE yang digunakan metanol, aquades, metanol 5% dan metanol oksalat. Selanjutnya sampel dianalisis menggunakan KCKT kolom ODS (oktadesil silika), elusi dilakukan dengan cara isokratik dan fase gerak yang digunakan adalah campuran asam oksalat-asetonitril(4:1) dan metanol dengan perbandingan elusi 90 : 10 laju alir 1 mL/menit .Menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 355 nm. Hasil analisis menunjukkan kadar tetrasiklin dalam sampel A 0,322 ppm, B 0,433 ppm, dan C 0,316 ppm. Hasil tersebut tervalidasi dengan nilai akurasi 58,3%, presisi 0,123%, batas deteksi 0,0654, dan batas kuantifikasi 0,218 ppm.   Kata Kunci: Hati Ayam,tetrasiklin, SPE, KCKT.