Abstrak: Permenkes Republik Indonesia No. 007 ayat 1 tentang industri dan usaha obat tradisional menyatakan bahwa obat tradisional dilarang mengandung bahan kimia hasil isolasi atau sintetik yang berkhasiat obat. Berdasarkan penelitian Badan Pengawasan Obat dan Makanan masih ditemukan obat tradisional yang mengandung bahan kimia obat (BKO), diantaranya adalah jamu diabetes. BKO yang sering ditambahkan dalam jamu diabetes adalah glibenklamid. Glibenklamid merupakan Obat Hipoglikemik Oral (OHO) golongan sulfonilurea yang hanya digunakan untuk mengobati individu dengan DM tipe II. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya glibenklamid yang terkandung pada jamu diabetes yang beredar di perdagangan. Penelitian ini dilakukan terhadap sepuluh sampel jamu dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT). KLT dilakukan menggunakan lempeng silika gel 60 F254 dengan menggunakan tiga kombinasi fase gerak yang berbeda yaitu butil asetat-kloroform-asam formiat (60:40:0,4); etil asetat-toluen-metanol (45:55:1); dan butil asetat-toluen- asam formiat (50:50:0,4). Dari sepuluh sampel jamu diabetes yang diuji dengan KLT sampel yang positif mengandung BKO glibenklamid yaitu sampel H dan J.   Kata kunci : bahan kimia obat, jamu diabetes, glibenklamid, KLT