Tujuan penelitian ini untuk mengetahui ada atau tidaknya aktivitas antibakteri ekstrak dan fraksi kulit buah pisang ambon matang (Musa x paradisiaca L.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (ATCC 25922), mengetahui nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dari ekstrak dan fraksi terhadap bakteri tersebut serta mengetahui kesetaraan fraksi terbaik terhadap pembanding. Pengujian dilakukan menggunakan metode difusi agar sumur. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanol, fraksi air-etanol dan fraksi etil asetat memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli pada konsentrasi 240 mg/mL, 260 mg/mL dan 310 mg/mL. Sedangkan fraksi n-heksan tidak memiliki aktivitas antibakteri pada kedua bakteri uji. Nilai KHM ekstrak kulit buah pisang ambon matang terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli secara berurutan adalah 240 mg/mL dan 170 mg/mL. Nilai KHM fraksi air-etanol terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli adalah 240 mg/mL. Nilai KHM fraksi etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli adalah 200 mg/mL. Kesetaraan fraksi terbaik (fraksi air-etanol) terhadap antibiotik Tetrasiklin HCl pada bakteri Staphylococcus aureus adalah 1 mg fraksi air-etanol setara dengan 4,735 x 10-6 mg Tetrasiklin HCl. Sedangkan pada bakteri Escherichia coli adalah 1 mg fraksi air-etanol setara dengan 1,375 x 10-5 mg Tetrasiklin HCl.