Senyawa sitotoksik adalah suatu senyawa atau zat yang dapat merusak sel normal dan sel kanker, serta digunakan untuk menghambat pertumbuhan sel tumor malignan. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui aktifitas sitotoksik yang dimiliki oleh biji dari tanaman salak (Salacca zalacca (Gaert.) Voss), serta menentukan golongan senyawa yang diduga menimbulkan aktifitas sitotoksik dari ekstrak terkuat. Adapun ekstrak biji salak diperoleh dengan menggunakan metode refluks secara bertingkat, dengan tiga pelarut berbeda, yaitu n-heksana, etil asetat, dan etanol. Konsentrasi ekstrak yang digunakan pada pengujian sitotoksik  dengan metode brine shrimp lethality test (BSLT) untuk ekstrak n-heksana dan etil asetat adalah 150, 175, 200, 225, 250 ppm, sedangkan untuk ekstrak etanol 70% yaitu 25, 50, 75, 100, 125 ppm. Nilai Lethal Concentration (LC50)yang diperoleh dari masing-masing ekstrak yaitu 148,48 ppm untuk ekstrak n-heksana, 212,86 ppm untuk ekstrak etil asetat dan 80,73 ppm untuk ekstrak etanol. Berdasarkan hasil analisis kualitatif menggunakan metode kromatografi lapis tipis terhadap ekstrak yang memiliki aktifitas sitotoksik terkuat, dapat diidentifikasi bahwa pada ekstrak tersebut terdapat senyawa golongan tanin, monoterpen/seskuiterpen, polifenolat dan alkaloid yang diduga memiliki aktifitas sitotoksik terhadap larva Artemia salina. Kata Kunci : Sitotoksik, biji salak,  Artemia salina, ekstraksi bertingkat, refluks, BSLT